OLYMPUS CKX53倒置顯微鏡熒光升級及
活/死細(xì)胞雙色熒光染色（Calcein AM / PI法）檢測應(yīng)用解決方案

基于 CKX-UVBG-E 電動智能熒光模塊的高效細(xì)胞活性評估指南

一、 方案背景與 Calcein AM / PI 雙色熒光檢測原理

在細(xì)胞生物學(xué)、組織工程、藥物篩選及腫瘤學(xué)研究中，精確評估細(xì)胞活力與死存狀態(tài)是基礎(chǔ)且關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。Calcein AM（乙氧基甲基熒光素阿醋酸酯）與 Propidium Iodide（碘化丙啶，PI）聯(lián)合使用的雙色熒光染色法，能夠同步對同一視野下的活細(xì)胞與死細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記，具有高靈敏度與直觀性強(qiáng)的特點(diǎn)。

1.1 雙色熒光探針的作用機(jī)制

二、 CKX53 倒置顯微鏡熒光升級方案（CKX-UVBG-E 模塊）

常規(guī)奧林巴斯 CKX53 顯微鏡主要用于明場及相襯活細(xì)胞觀察。通過加裝專為 CKX53 量身開發(fā)的 CKX-UVBG-E 電動智能熒光模塊，無需更換顯微鏡主體即可快速升級為高性能倒置熒光顯微平臺：

2.1 高度集成一體化與內(nèi)陷槽緊湊安裝設(shè)計

CKX-UVBG-E 模塊將大功率 LED 光源與熒光激發(fā)塊高度集成于單一盒體內(nèi)，采用了內(nèi)陷安裝槽與殼體卡扣設(shè)計，結(jié)構(gòu)緊湊且外部固定螺絲少。升級后熒光模塊極薄，不遮擋載物臺下方空間，確保物鏡轉(zhuǎn)換順暢無阻。

2.2 電動智能通道切換與 1.44 英寸彩色大屏

模塊配備 1.44 英寸彩色顯示屏，以彩色方柱和百分比數(shù)值清晰顯示當(dāng)前通道狀態(tài)及激發(fā)光亮度。實(shí)體按鍵與編碼標(biāo)記讓通道切換一目了然；配合防滑指壓旋鈕，單指即可快速旋轉(zhuǎn)與點(diǎn)擊操控，極大提升了實(shí)驗(yàn)效率。

2.3 長壽命 LED 光源與通道光強(qiáng)智能記憶

采用大功率 LED 光源（使用壽命 > 30000 小時），即開即用，無需傳統(tǒng)高壓汞燈繁瑣的預(yù)熱與冷卻等待。系統(tǒng)支持多達(dá) 4 色獨(dú)立熒光通道，內(nèi)置通道光強(qiáng)記憶功能——當(dāng)在 B 通道（檢測 Calcein 綠光）與 G 通道（檢測 PI 紅光）之間切換時，模塊能自動還原之前設(shè)定的光照強(qiáng)度，避免重復(fù)微調(diào)導(dǎo)致樣本熒光淬滅。

2.4 低風(fēng)噪主動循環(huán)散熱與軟件聯(lián)動擴(kuò)展

模塊內(nèi)置低風(fēng)噪、低震動風(fēng)扇進(jìn)行主動循環(huán)風(fēng)散熱，有效保障 LED 燈珠與濾光片的溫度穩(wěn)定，防止光譜中心波峰漂移。同時，模塊支持外部協(xié)議通訊與軟件聯(lián)動控制，可無縫對接電腦端的圖像采集與分析軟件。

三、 Calcein AM / PI 雙色熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)解決方案流程

為確保升級后的 CKX53 顯微鏡在進(jìn)行 Calcein AM / PI 雙色檢測時獲得高信噪比與高重復(fù)性的數(shù)據(jù)，建議遵循以下標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)施流程：

步驟 1：試劑配制與細(xì)胞樣品洗滌

• 工作液配制：使用無熒光背景的無血清培養(yǎng)基或 PBS 緩沖液將 Calcein AM 與 PI 儲存液稀釋成雙染色工作液（建議終濃度：Calcein AM 約 2 μM，PI 約 4 μM），現(xiàn)配現(xiàn)用并避光保存。

• 樣品洗滌：取待測貼壁或懸浮細(xì)胞（如 96 孔板或 35mm 培養(yǎng)皿中的細(xì)胞），用溫育的 PBS 輕輕洗滌 1–2 次，消除培養(yǎng)基中血清酯酶成分對 Calcein AM 的干擾。

步驟 2：樣品孵育與染色

• 加入染色液：向細(xì)胞樣品中加入適量配制好的 Calcein AM / PI 雙染色工作液，確保覆蓋細(xì)胞層。

• 避光溫育：置于 37°C、5% CO? 細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光溫育 15–30 分鐘。孵育完成后可直接觀察（若背景較高，可用 PBS 輕輕洗滌一次）。

步驟 3：CKX53 上樣與明場/相襯快速定位

• 放置樣品：將培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿置于 CKX53 載物臺上，調(diào)節(jié) Universal Holder 通用標(biāo)本夾固定。

• 相襯尋焦：開啟 LED 明場光源，利用 iPC 整合相襯系統(tǒng)（4X–40X 切換無需換相襯環(huán)）快速尋找代表性視野并完成對焦與細(xì)胞形態(tài)初檢。

步驟 4：電動智能熒光通道切換與采集

• B 通道采集（活細(xì)胞）：通過 CKX-UVBG-E 單指按鍵一鍵切換至 B 激發(fā)通道（FITC），LED 光源開啟，快速對焦并采集活細(xì)胞黃綠熒光圖像（胞質(zhì)發(fā)光）。

• G 通道采集（死細(xì)胞）：按下按鍵快速切換至 G 激發(fā)通道（TRITC），智能還原預(yù)設(shè)紅光功率，采集死細(xì)胞紅色熒光圖像（胞核發(fā)光）。

步驟 5：圖像合成與細(xì)胞存活率定量評估

• 圖像傳輸與疊加：通過相機(jī)接口將圖像傳輸至電腦，利用配套分析軟件對 FITC 綠光通道與 TRITC 紅光通道進(jìn)行 Overlay/Merge 通道疊加。

• 存活率計算：分別統(tǒng)計視野內(nèi)的綠光活細(xì)胞數(shù)（Live）與紅光死細(xì)胞數(shù)（Dead），計算細(xì)胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

四、 典型圖像結(jié)果與數(shù)據(jù)評估

在 CKX53 優(yōu)良光學(xué)系統(tǒng)與升級后 CKX-UVBG-E 模塊的支撐下，Calcein AM / PI 雙色染色呈現(xiàn)出清晰的形態(tài)學(xué)與熒光光譜特征：

五、 規(guī)范操作注意事項(xiàng)與設(shè)備保養(yǎng)建議

5.1 染色時間控制：孵育時間過長可能導(dǎo)致 Calcein 滲出胞外增加背景熒光，或 PI 少量被活細(xì)胞內(nèi)吞造成誤判，建議控制在 15–30 分鐘內(nèi)完成觀察。

5.2 LED 激發(fā)強(qiáng)度適度調(diào)控：充分利用 CKX-UVBG-E 模塊的無級調(diào)光與光強(qiáng)記憶功能，在拍攝對比度滿足的前提下適當(dāng)調(diào)低激發(fā)功率，減緩熒光探針淬滅。

5.3 風(fēng)扇風(fēng)道防堵與清潔：保證熒光模塊側(cè)面主動散熱風(fēng)扇的風(fēng)道通暢，避免遮擋，定期用干燥氣吹清理風(fēng)扇網(wǎng)罩灰塵。

5.4 鏡片與部件擦拭維護(hù)：若載物臺或物鏡沾染培養(yǎng)基或染色液，應(yīng)及時用 75% 乙醇濕潤無塵紙輕輕擦拭，保持優(yōu)良的透光性能與設(shè)備衛(wèi)生。